Site Dating Expresie aga ata,

Subiecte Abstract Carotenoizii joacă un rol important în numeroase procese fiziologice în plante, iar gena fitoen desaturază PDS3 codifică una dintre enzimele importante în calea biosintezei carotenoidului. Completarea funcțională a confirmat că ambele fenotipuri albinoși și pitic ale mutantului pds3 au rezultat din perturbarea funcțională a genei PDS3. Dezvoltarea cloroplastului a fost stopată în Site Dating Expresie aga ata proplastid al mutantului pds3.

Analiza ulterioară a arătat că un nivel ridicat de fitoen a fost acumulat în mutantul pds3.

Adăugarea GA 3 exogenă ar putea salva parțial fenotipul pitic, sugerând că fenotipul pitic al mutantului pds3 se poate datora deficienței GA. Analizele microarray și RT-PCR au arătat că întreruperea genei PDS3 a determinat modificări ale expresiei genei implicate în cel puțin 20 de căi metabolice, incluzând inhibarea multor gene în căile de biosinteză a carotenoidului, clorofilei și GA. Datele noastre sugerează că fitoena acumulată în mutantul pds3 ar putea juca un rol important în anumite feedback-uri negative pentru a afecta exprimarea genică a diferitelor căi celulare.

Introducere Carotenoizii, pigmenții lipidici legați în membrană, incluzând carotenul și xantofilul, sunt o clasă de compuși de hidrocarburi C40 formate prin condensarea izoprenoidelor 1. Ele joacă un rol important într-un număr mare de procese fiziologice în plante.

5 Best Japanese Dating Sites [CRAZY Popular!]

Carotenoizii acționează Site Dating Expresie aga ata pigmenți auxiliari în fotosinteză și formează unitățile structurale de bază ale antenelor fotosintetice. Acestea servesc, de asemenea, ca agenți de protecție fotografică prin stingerea oxigenului singlet care poate deteriora altfel clorofila.

În plus, carotenoizii servesc ca precursori în biosinteza vitaminei A și a acidului abscisic ABA. Multe studii clinice au demonstrat că carotenoidele funcționează ca agenți de stingere a radicalilor liberi în multe căi fiziologice 2. Deși carotenoizii sunt sintetizați în plastide, toate enzimele implicate în biosinteza lor sunt codificate de gene nucleare. GGPP este apoi transferat în trei căi: 1 pentru a forma β-caroten, care duce în cele din urmă la sinteza ABA 1, 3 ; 2 pentru a forma gibbereline GA 4 și 3 pentru a forma clorofila 5.

Desaturarea fitoenelor este o etapă importantă în calea biosintezei β-carotenului. Enzima responsabilă pentru această etapă este desaturaza fitoenică PDSținta unui erbicid Norflurazon 6 important din punct de vedere comercial.

Gena PDS a fost mai întâi clonată din cianobacteria 7. Genele PDS omoloage au fost apoi clonate din soia 8, piper 9, roșii 10, 11, Arabidopsis 12 și porumb Carotenoide, clorofila și căile biosintezei GA.

Enzimele pentru care expresia genelor lor de codare corespunzătoare au fost analizate cantitativ prin RT-PCR în această lucrare sunt îndrăznețe, iar celelalte enzime sunt subliniate.

PDS3 este boldfaced și bracketted. Imagine de dimensiune completă Etapa de desaturare fitotonă în Site Dating Expresie aga ata carotenoidului Site Dating Expresie aga ata fost de asemenea studiată prin utilizarea de mutanți în Arabidopsis. Faptul că genele PDS1 și PDS2 codifică 4-hidroxifenilpiruradioxigenaza și respectiv prenilfiltratransferaza 14, 15 sugerează că plastochinona este un purtător de electroni intermediar critic pentru transportul de electroni în reacția de desaturare a fitonei.

Un alt mutant Arabidopsis, imutans, acumulează fitoenă în țesuturile albe variate. Gena IMMUTANS codifică oxidaza terminală plastidă, a cărei întrerupere împiedică oxidarea în timpul biosintezei clorofilei și are ca rezultat acumularea fitoenelor 16, Cu toate acestea, nu au fost raportate mutații ale genei care codifică însăși desaturaza fitoenului denumită PDS3 Analiza expresiei genei PDS3 care codifică desaturaza fitoenică a indicat că este foarte reglată de lumina 18, 19 în tomate.

Cu toate acestea, analiza mutantului imutan a arătat că expresia genei PDS3 nu a fost neapărat corelată cu cantitatea de pigmenți Negru femeie cauta alb celule Am obținut un nou mutant albinotic recesiv dintr-o colecție de mutanți de inserție T-ADN din Arabidopsis generați în centrul nostru.

Analiza ulterioară a arătat că fitoena acumulată mutant și GA exogen ar putea salva parțial fenotipul pitic al mutantului. Tehnicile moleculare și microarray au fost utilizate pentru a investiga rolul desaturației fitoene și cauzele care stau la baza fenotipurilor albinoși și pitic în mutantul pds3. Material si metode Mutagenesis și creșterea Arabidopsis Arabidopsis de ecotype Columbia col-0 au fost crescute la 22 ° C în condiții de zile lungi.

Metoda de înflorire florală 21 a fost utilizată pentru a genera Arabidopsis transgenic cu Agrobacterium GV care conține pSKI Răsadurile verzi au fost transferate în sol și plasate în aceleași condiții ca cele descrise mai sus.

• Agricultura feminina se intalne te
• Site ul francez de dating gratuit

Cinci pmol din fiecare dintre cei trei primeri și 20 ng de ADN genomic au fost prezenți în 25 pl din amestecul de reacție PCR. După denaturare la 95 ° C timp de 2 minute, reacția a fost apoi supusă la 30 cicluri de denaturare 94 ° C timp de 30 de secunderecoacere 58 ° C timp de 30 de secunde și extensie 72 ° C timp de 45 de secunde. Fenotipurile mutantului pds3. După tratamentul la rece la 4 ° C timp de trei zile, semințele de tip sălbatic și pds3 mutante au crescut la 22 ± 2 ° C în condiții de lumină lungă și s-au comparat la diferite stadii de dezvoltare.

El o sa faca fasole.

A de tip sălbatic de 5 zile. B ZHJ în vârstă de 5 zile. D Tip sălbatic de 21 de zile. E ZHJ de 21 de zile. G ZHJ de 42 de zile. J Analiza de co-segregare a mutantului pds3.

K Analiza de expresie a genei PDS3 la tipul sălbatic și a mutantului pds3. Gena tubulinei β- TUB2 a fost utilizată ca un control intern. După o etapă de denaturare inițială de un minut la 94 ° C, amplificarea a trecut prin 30 de cicluri constând din denaturare la 94 ° C timp de 30 de secunde, recoacere la 65 ° C timp de 30 de secunde, urmată de prelungire la 72 ° C timp de 2 minute.

Produsul amplificat a fost recuperat din gel de agaroză cu punct de topire scăzut și apoi ligat în situsul EcoRV al pBS după purificare. Transformarea Arabidopsis După ce au fost tratați cu enzime de restricție adecvate, inserția din plasmida recombinantă pBPDS a fost recuperată din geluri de agaroză cu punct de topire scăzut, purificată și apoi legată în vectorul de expresie vegetală pWM, pentru a genera pWPDS3 Figura 3A.

Plantele mutante heterozigote PDS3-pds3 au fost utilizate Site Dating Expresie aga ata recipiente pentru transformarea mediată de Agrobacterium prin metoda de înflorire florală.

ARN-urile mici se modifică pe calea către stările celulare distincte de pluripotență indusă

Fenotipul de salvare a mutantului pds3 de către o transgenă PDS3 de tip sălbatic. Diferitele elemente ale vectorului sunt reprezentate de cutii cu culori diferite; orientarea transcripțională este indicată de săgeată. M: scară de bp; 1: control martor; 2: tip sălbatic; 3: mutantul homozigot pds3-pds3 ; 4: mutant heterozigot PDS3-pds3 ; trei plante independente de genotipuri diferite au fost separate de mutantul heterozgos PDS3-pds3 transformat cu pWPDS3.

Imagine de dimensiune completă Două primeri au fost proiectate pe baza secvenței genei HPTII din pWM și utilizate pentru a confirma succesul transformării. După o etapă inițială de denaturare de 2 minute la 95 ° C, amplificarea a continuat prin 30 de cicluri constând din denaturare la 94 ° C timp de 30 de secunde, recoacere la 58 ° C timp de 30 de secunde, urmată de prelungire la 72 ° C timp de 1 min. Reacția a fost lăsată să se desfășoare la 42 ° C timp de 50 min înainte de a fi terminată prin tratare la 70 ° C timp de 15 min.

RT-PCR s-a efectuat într-un volum de reacție de 25 pL constând din 0, 25 pL de produs cADN de primă catenă și 5 pmoli fiecare perechi de primer, cu o pereche pentru o genă specifică, iar cealaltă pentru gena tubulinei control intern.

După o etapă de denaturare inițială de un minut la 94 ° C, amplificarea a constat în denaturarea la 94 ° C timp de 30 de secunde, recoacerea la 54 ° C timp de 30 de secunde, urmată de prelungirea la 72 ° C timp de 1 min. Pentru fiecare gena analizată, s-a repetat RT-PCR în mod independent de trei ori, s-au calculat numărarea medie a intensității relative și s-au efectuat t- teste pentru compararea perechilor de mijloace. Între timp, plantele de tip sălbatic de tip sălbatic și plantele mutante pds3 au fost colectate, de asemenea, pentru Site Dating Expresie aga ata carotenoidului.

Protocolul utilizat pentru extracția carotenoidelor solubile în lipide a fost ușor modificat față de raportul anterior Timpii de retenție relativ la standardele cunoscute, utilizând detectarea la ambele și nm, au fost folosite pentru a identifica clorofilele și carotenoizii.

Deoarece în acest laborator nu a fost disponibil un standard fitoen, au fost utilizate ca standarde carotenoidele extrase din Arabidopsis de tip sălbatic tratate cu erbicidul Norflurazon, în care sa acumulat fitoena Analiza microarray Experimentele microarray și analiza datelor au fost efectuate conform unui protocol stabilit anterior O combinație de ADNc de tip sălbatic și o cantitate egală de ADNc mutant a fost utilizată pentru a sonda simultan un diapozitiv Site Dating Expresie aga ata sticlă care conține matrice duplicat în trei experimente microarray.

Fiecare experiment a fost repetat cu etichetare inversă. Analiza microscopului electronic Secțiuni de țesut de frunze au fost preparate pentru observarea EM în conformitate cu un protocol descris anterior 28 cu modificări minore. Pe scurt, țesutul de frunze Arabidopsis a fost fixat cu glutaraldehidă, apoi fixat cu tetroxid de osmiu și deshidratat într-o serie de etanol înainte de a fi infiltrat cu Spurr Dow Chemical Co. Polimerizarea a fost condusă la 70 ° C timp de 8 ore.

Specimenele au fost tăiate pentru a obține secțiuni ultra-subțiri LKB, Suedia și apoi au fost colorate cu acetat de uranil și citrat de plumb alcalin înainte de a fi examinate cu un microscop electronic cu transmisie JEMS.

Rezultate Izolarea unui nou mutant albinotic Dintr-o colecție de mutanți de inserție T-ADN din Arabidopsis pe care i-am generat recent, semințele T2 de 2 de linii au fost testate pentru fenotipuri observabile. A fost analizată ulterior o linie ZHJ cu un fenotip albinic.

Mutantul homozigot a fost complet albinic și nu poate să crească în sol. În timp ce germinează în mod normal, mutantul avea cotiledoane purpuri care au fost albite treptat până la alb complet cu perioadă de creștere extinsă Figura 2B, 2E, 2G. Mutantul a fost foarte întârziat în dezvoltare, prezentând un fenotip sever de pitic cu frunze mici de rozetă. Nu s-a observat nicio șuruburi în niciuna dintre aceste plante mutante cultivate Figura 2G. O inserție a fost localizată în al doilea intron al genei fitoene desaturază At4g în acest mutant Figura Am desemnat acest mutant ca pds3 pentru motivele discutate în secțiunile următoare.

Când semințele T3 din diferite linii verzi T2 au fost plantate pe mediu MS fără selecție PPT, testul χ 2 a arătat că numărul de plante verzi față de cel al albinelor a fost de 3: 1, sugerând că fenotipul a fost cauzat de o singură mutație recesivă. Primerii au fost proiectați pentru a amplifica un fragment de bp din planta de tip sălbatic și un fragment de bp din mutantul homozigos.

Aceste date susțin în continuare că fenotipul albino-ului a fost cauzat de inserția T-ADN. Gena PDS3 completează fenotipurile albinoși și pitic Pentru a afla dacă întreruperea PDS3 a fost responsabilă pentru fenotipul albinic, am încercat să salvăm fenotipul prin introducerea unui cADN al genei PDS3 condus de promotorul 35S înapoi în mutant.

Atunci când vectorul care conține gena PDS3 de tip sălbatic a fost construit Figura 3A și transformat în plante heteroziogice pds3, am reușit să obținem descendenți homozigoți pentru pds3 încă cu fenotip de tip sălbatic Figura 3B-D. Analiza fenotipică suplimentară a plantelor salvate a indicat că gena PDS3 ar putea completa complet fenotipul albinozei și toate celelalte anomalii asociate, inclusiv nancyismul, letalitatea și infertilitatea Figura 3D.

Pentru a confirma în continuare contribuția distrugerii genei PDS3 la fenotipul observat al mutantului pds3, a fost construită o transgenă ARNi pentru PDS3 sub promotorul 35S puternic constitutiv și introdusă în Arabidopsis de tip sălbatic.

Toate plantele transgenice ARNi examinate au prezentat, într-o măsură diferită, fenotipuri similare cu cele ale mutantului pds3 Informații suplimentare, Figura S1.

Acest rezultat a confirmat în continuare că fenotipul mutantului nostru inițial pds3 a fost strict datorat perturbării genei PDS3, oferind astfel baza pentru desemnarea mutantului ca pds3.

Niveluri Site ul de intalnire obez de fitoen se acumulează în mutantul pds3 HPLC a fost efectuat pentru a examina conținutul de carotenoid și alte pigmenți în mutantul pds3. Analiza a arătat că vârfurile de clorofil și β-caroten identificate în plantele de tip sălbatic au fost absente în mutantul pds3 Figura 4. Mai mult, cele trei vârfuri principale care au fost observate în mutantul pds3 au avut loc în aceeași poziție în care fitoena ar apărea în mod normal în plantele tratate cu erbicidul Norflurazon Figura 4.

Cele trei vârfuri sunt probabil cis- și trans-izoformele fitoenelor. Aceste date au indicat faptul că fitoena se Site Dating Expresie aga ata în mutantul pds3 datorită pierderii activității de desaturare a fitoenelor, care a condus, de asemenea, la absența clorofilei și a β-carotenului. Analiza HPLC a carotenoidelor în frunzele de plante de tip sălbatic, de tip sălbatic, de tip mutant pds3 și Norflurazon.

Spectrele de absorbție la nm și nm sunt indicate prin linii roșii și, respectiv, albastre. L, luteină; Cb, clorofila b; Ca, clorofila a; β, β-caroten. Imagine de dimensiune completă Fenotipul dwarf al pds3 ar putea rezulta din deficiența GA Constatarea că mutantul pds3 a fost sever negativ, împreună cu faptul că GGPP este necesar pentru biosinteza carotenoidului, clorofilei și GA, a ridicat posibilitatea ca biosinteza GA în mutantul pds3 să fie întreruptă.

Analiza semi-cantitativă RT-PCR a arătat că expresia genei care codifică sintaza de copilil difosfat sintetază CPSprima enzimă din calea de biosinteză GA angajată, a fost în mare măsură redusă în mutantul homozygos pds3 dar nu a fost afectat în tipul sălbatic sau heterozygos plantele pds3 figurile 5A și 5B.

Acest lucru a sugerat că mutația pds3 a afectat expresia genelor implicate în angajamentul față de biosinteza GA. Apoi, am testat dacă GA exogen ar putea salva fenotipul pitic al mutantului pds3.

În comparație, plantele pds3 fără GA exogene au fost infertile cu staminele și pistilii degenerați datele nu sunt prezentate.

• Cerere pentru intalniri pentru adul i
• Barbati din Reșița care cauta femei singure din Timișoara

Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că fenotipul pitic în mutantul pds3 ar putea fi cauzat de deficiența GA. Mutantul pds3 ar putea fi deficitar al GA. M: scară de bp; TUB2 : gena β-tubulină ca control intern. Imagine de dimensiune completă Distrugerea genei PDS3 duce la inhibarea multor alte gene implicate în căile de biosinteză a carotenoidului, clorofilei și biosintezei GA Pentru a examina sistematic posibilele efecte ale mutației pds3 asupra altor căi biosintetice înrudite, au fost alese nouă gene reprezentative pentru analiza semi-cantitativă RT-PCR prezentată în Figura 1.

Rezultatele au arătat Site Dating Expresie aga ata cele nouă gene au împărtășit un model similar de expresie.

Celule stem pluripotent Abstract MicroRNAs miRNAs sunt critice pentru reprogramarea celulelor somatice în celule stem pluripotent induse iPSCtotuși, exact modul în care schimbările expresiei miRNA susțin tranziția spre pluripotență necesită investigații suplimentare.

Nivelul de exprimare al majorității genelor a fost comparabil între plantele pds3 de tip sălbatic și heterozygos, dar redus în mod clar în plantele mutante homozigotă pds3 Figura 6.

Aceste date au indicat faptul că expresia multor gene implicate în căile de biosinteză a carotenoidului, GA și clorofilei a fost redusă prin întreruperea genei PDS3.

Analiza de expresie a genelor implicate în căile biosintetice asociate în mutantul heterozygos PDS3-pds3 2 și al mutantului homozigos pds3-pds3 3. Imagine de dimensiune completă Căile metabolice și genele cloroplastice codificate nucleare au fost afectate în mutantul pds3 Pentru a investiga în continuare efectele genei mutante PDS3 asupra altor căi metabolice, am comparat profilul de exprimare a genomului răsadurilor mutante pds3 cu cel al tipului sălbatic folosind analiza microarray.

Microarray-ul conținea un total de 9 EST, reprezentând aproximativ 6 de gene unice Un total de de gene unice au prezentat expresia diferențială dublă sau mai mare Site Dating Expresie aga ata pds3 în comparație cu tipul sălbatic, cu fiind reglate în sus și reglate în jos.

Dintre cele de gene diferențiate, au funcții cunoscute sau au o paralelitate de secvență partajată cu genele funcțiilor cunoscute, în timp ce restul au fost gene cu funcție necunoscută Informații suplimentare, Tabelul S1. Printre aceste gene cloroplastice codificate nucleare, șapte gene de proteină care Babo Dating Site clorofila și trei gene proteice ale fotosistemei, implicate în fotosinteză și ciclul Calvin, au fost reglate în jos, ceea ce indică faptul că reacțiile de lumină și întuneric au fost reprimate Tabelul 1.

Aceste date sunt în concordanță cu ideea că lipsa carotenoidelor și a clorofilei în mutantul albus pds3 ar conduce la reprimarea genelor proteinei care leagă clorofila și fotosintezei. Dezvoltarea cloroplastului este stopată în stadiul proplastid al mutantului pds3 Pentru a examina stadiul de dezvoltare al plastidelor în mutantul pds3, plastidele de celule mezofile din puieți mutanți pătrimi de 5 d, 30 d și 90 d vechi au fost analizați prin microscopie electronică de transmisie.